O projektu

Sarkomi su heterogena skupina malignih tumora vezivnog tkiva koji imaju mezenhimsko podrijetlo. Unatoč primjeni različitih vrsta terapija (resekcija, zračenje, kemoterapija) smrtnost pacijenata oboljelih od sarkoma je disproporcionalno visoka u odnosu na smrtnost pacijenata oboljelih od drugih vrsta raka. Najčešći uzrok tome je kasna dijagnoza i uznapredovalost bolesti kada se počnu javljati simptomi. Također, unatoč jakim terapijama, česti su recidivi i metastaziranje. 
Istraživanja biologije raka su dovela do hipoteze o matičnim stanicama raka, engl. cancer stem cells (CSC). Jedna definicija CSC jest da je to mala subpopulacija stanica tumora koje imaju sposobnost samoobnavljanja i stvaranja heterogenih staničnih linija koje sačinjavaju tumor. CSC mogu poteći iz normalnih matičnih stanica koje genetičkim i epigenetičkim promjenama mogu poprimiti tumorogeni fenotip. Međutim, mogu nastati i iz diferenciranih stanica koje malignom transformacijom steknu svojstva matičnih stanica. Smatra se kako bi se upravo njihovim uklanjanjem moglo lakše pristupiti liječenju i iskorjenjivanju tumora u pacijenta. 
Preliminarni rezultati pokazuju da askorbinska kiselina (engl. ascorbic acid, AA) ima jaki citotoksični učinak na matične stanice sarkoma, dok ne utječe na vijabilnost drugih testiranih stanica. Kada je AA prisutna u fiziološkoj koncentraciji pokazuje antioksidativna svojstva. Farmakološke doze AA su više i mogu se postići samo intravenskim unosom, međutim uslijed oksidacije dolazi do visoke razine H2O2.  Budući da je za postizanje antitumorskog učinka potrebna visoka koncentracija AA u krvi, to je limitirajući čimbenik za upotrebu AA in vivo. 
Kako bi se istražio utjecaj AA na CSC, iz uzoraka sarkoma 30 pacijenata će se izolirati matične stanice raka. To će se postići uzgojem stanica sarkoma u restriktivnim uvjetima (medij bez seruma, nemogućnost prianjanja za podlogu). CSC će formirati sarkosfere te se tako izdvojiti od ostalih stanica tumora.  Nakon izolacije stanica iz formiranih sarkosfera, postupak će se ponoviti te bi se trebala formirati druga generacija sarkosfera. Tako izolirane CSC bit će karakterizirane testom izbacivanja boje, aktivnosti aldehid dehidrogenaze te imunohistokemijskim bojanjem specifičnih markera. 
Utjecaj AA će se proučiti kroz tri njena oblika – askorbinsku kiselinu, dehidroksiaskorbinsku kiselinu (DHA) i askorbil palmitat (AP). Međutim, kako bi se izbjegle nuspojave u potencijalnoj kliničkoj primjeni, sva tri oblika AA će se ugraditi i u čvrste lipidne nanočestice (engl. solid lipid nanoparticles, SLN) koje će biti sintetizirane tehnikom mikroemulzije ulja u vodi.
Matične stanice sarkoma 30 pacijenata, mezenhimske matične stanice i stanične linije U2OS i HEK293 tretirat će se fiziološkim i farmakološkim koncentracijama AA, DHA i AP bez i sa SLN , a zatim će se detektirati preživljenje stanica kako bi se dobile krivulje stupnjevitog odnosa doza-učinak (engl. dose-response curve) te inhibicijske koncentracije (IC50) za svaki tretman. Dobivene vrijednosti IC50 će se koristiti za analizu tipa stanične smrti analizom markera autofagije, apoptoze i nekroze. 
Kako bi se odredio uzrok osjetljivosti stanica na AA nakon izolacije RNA i prevođenja u cDNA reverznom transkripcijom, napravit će se kvantitativni PCR za panele gena. Tražit će se promjene u ekspresiji gena važnih u metabolizmu glukoze, regulaciji oksidativnog stresa i diferencijaciji. Također, iz tretiranih stanica će se izolirati proteini te metodom Western blot potvrditi razina ekspresije proteina koji su u qPCR analizi pokazali značajne promjene. 
Cilj ovog istraživanja je razjasniti na koji način askorbinska kiselina utječe na vijabilnost matičnih stanica sarkoma i procijeniti količine AA koje su potrebne kako bi se postigao antitumorski učinak. AA je dostupna i jeftina i potencijalno bi se mogla koristiti kao dodatak standardnoj kemoterapiji s ciljem uništavanja subpopulacije matičnih stanica unutar tumora.