Strategije patogenosti fitoplazmi: efektori, faktori virulencije i pokretni genetički elementi

Trajanje projekta - od 01.02.2020. do 31.08.2024.

Voditeljica projekta:

Prof. dr. sc. Martina Šeruga Musić
 

Istraživačka skupina:

Prof. dr. sc. Martina Šeruga Musić, PMF, Sveučilište u Zagrebu, Hrvatska

Prof. dr. sc. Dijana Škorić, PMF, Sveučilište u Zagrebu, Hrvatska

Marina Drčelić, Mag. Biol. Exp., PMF, Sveučilište u Zagrebu, Hrvatska

Andreja Škiljaica, Mag. Biol. Mol., Sveučilište u Zagrebu, Hrvatska

Prof. dr. sc. Saskia Hogenhout, John Innes Centre. Ujedinjeno Kraljevstvo

Dr. sc. Xavier Foissac, HDB, INRA - Centre de Bordeaux, Francuska

Prof. dr. sc. Chih-Horng Kuo, Institute of Plant and Microbial Biology, Academia Sinica, Tajvan

Sažetak

Bakterije roda 'Candidatus Phytoplasma', trivijalnog imena fitoplazme, su pleomorfni unutarstanični patogeni, uzročnici brojnih ekonomski značajnih bolesti biljaka u čitavom svijetu. U prirodi se prenose putem kukaca-vektora koji se hrane biljnim sokom, a kompleksni životni ciklusi ovih bakterija obavezno uključuju parazitiranje i u biljnim domaćinima i u kukcima. Uzgoj ovih bakterija u čistoj kulturi in vitro još uvijek je neuspješan, što znatno otežava njihovu klasifikaciju i karakterizaciju, kao i istraživanja mehanizama i strategija patogenosti. Metagenomički pristup te napredak tehologija sekvenciranja omogućili su uspješno sastavljanje nekolicine potpunih genoma fitoplazmi i genomskih skica, od kojih je jedna rezultat prethodnog uspješno završenog uspostavnog istraživačkog projekta. Otkriveno je kako su mali genomi ovih patogena (530-1350 bp) reducirani u mnogim osnovnim metaboličkim putevima, no bogati ponavljajućim sljedovima i karakterističnim pokretnim genetičkim elementima (potential mobile unit; PMU). Era genomike donijela je nove mogućnosti pronalaženja potencijalnih faktora virulencije, efektora te ostalih mehanizama putem kojih fitoplazme ostvaruju svoju patogenost i uspješno manipuliraju biljnim domaćinima i kukcima. Do sada je istraženo tek nekoliko efektora, malih proteina fitoplazmi, za koje je detaljno razjašnjen mehanizam djelovanja i interakcije s biljnim domaćinom. U prethodnom HRZZ projektu, sekvenciranjem i detaljnim komparativnim analizama genoma soja SA-1 fitoplazme 'Ca. P. solani', pomoću bioinformatičkih alata identificirano je 38 gena potencijalnih efektora. Za njih 5 utvrđeno je kako su jedinstveni upravo za ovaj soj, a 3 za vrstu 'Ca. P. solani'. U sklopu ovog projekta provele bi se funkcionalne studije odabranih potencijalnih efektora dobivenih u prethodnom istraživanju te istražila njihova raznolikost i polimorfizam unutar vrste. Isto tako, istražila bi se raznolikost potencijalnih mobilnih jedinica (PMUs) unutar kojih su često smješteni upravo geni za efektorske proteine. Smatra se da podložnost rekombinanciji, kao i česti horizontalni prijenos ovih genetičkih elemenata, pridonose prilagodbi različitim domaćinskim vrstama. No, mehanizmi regulacije i prijenosa jos uvijek nisu razjašnjeni. Kod većine patogenih bakterija, površinski i membranski proteini imaju značajnu ulogu u interakcijama s domaćinskim stanicama, a osobito početnim stadijima infekcije, te se smatraju važnim faktorima virulencije. Stoga bi se u sklopu ovoga projekta provela istraživanja interakcije membranskog proteina Stamp fitoplazme 'Ca. P. solani' s mikrofilametima kukaca-vektora, o čemu još uvijek u literaturi nema podataka. Naglasak bi bio na specifičnosti ovih interakcija ovisno o genotipu fitoplazme te vrsti i populaciji/ekotipu kukca-vektora. Metodologija koja će biti korištena u svrhu ostvarivanja ciljeva ovog projekta uključuje upotrebu relevantnih, ranije uspješno korištenih laboratorijskih metoda te uvođenje i optimizaciju nove metode sa svrhom kvantifikacije interakcije proteina, kao i upotrebu bioinformatičkih oruđa i računalnih programa. Između ostalog, to su sljedeće metode I tehnologije: PCR i real-time PCR, sekvenciranje po Sangeru te uređivanje, sravnjivanje i filogenetska analiza sekvenci korištenjem raznih računalnih programa i programskih paketa, high-throughput sekvenciranje (HTS) na platformi Illumina MiSeq, metoda bimolekulske fluorescencijske komplementacije (BiFC), yeast –two-hybrid assay (Y2H), in vitro metoda kopurifikacije (pull-down), luciferase assay, Southern blot…. Fitoplazma 'Ca. P. solani' kozmopolitski je patogen s vrlo širokim krugom domaćina, uključujući gospodarski značajne kulture (vinova loza, kukuruz, krumpir, rajčica, paprika itd.), a prenosi si se putem više vrsta kukaca-vektora. Ujedno, ima jedan od najvećih i najvarijabilnijih genoma unutar roda 'Ca. Phytoplasma'. Ova fitoplazma jedna je od najraširenijih fitoplazmi u agro-ekološkim nišama u Hrvatskoj. Stoga bi znanja o specifičnim efektorima i interakcijama s biljnim domaćinima i kukcima ukazala na faktore koji određuju njenu prilagodljivost različitim domaćinima i ekološkim sustavima, te zajedno s podacima o molekularnoj epidemiologiji dala nove mogućnosti u pronalasku rješenja kontrola širenja ovog patogena.